小鼠ELISA試劑盒的雙抗體夾心法

　　以下是本生對小鼠ELISA試劑盒雙抗體夾心法的詳細(xì)操作流程及關(guān)鍵要點(diǎn)，綜合多來源實驗方案整理：

　　一、實驗原理

　　通過兩種特異性抗體(包被抗體與酶標(biāo)抗體)分別結(jié)合抗原的不同表位，形成"固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體"復(fù)合物，最終通過酶催化底物顯色定量抗原濃度?。

　　二、操作步驟

　　包被抗體固定?

　　用包被緩沖液稀釋抗體至1-10μg/mL，每孔加入100μL，4℃過夜或室溫孵育3小時?。

　　甩盡孔內(nèi)液體，用PBST洗滌3次(每次浸泡3分鐘，拍干)?。

　　封閉非特異性位點(diǎn)?

　　加入200μL含5%脫脂奶粉的PBST封閉液，室溫孵育1小時?。

　　再次洗滌3次，去除未結(jié)合封閉蛋白?。

　　加樣與孵育?

　　標(biāo)準(zhǔn)品?：梯度稀釋(通常S1-S7)后每孔加100μL，從低濃度到高濃度懸空加入?。

　　樣本?：離心取上清，每孔加50-100μL，覆膜后37℃孵育90分鐘?。

　　酶標(biāo)抗體反應(yīng)?

　　加入生物素化抗體工作液100μL/孔，37℃孵育60分鐘，洗滌5次?。

　　加入HRP標(biāo)記鏈霉親和素(按1:100稀釋)，避光孵育20分鐘?。

　　顯色與終止?

　　每孔加TMB底物90μL，避光反應(yīng)15-30分鐘(顯藍(lán)色梯度)?。

　　加入50μL終止液(2M硫酸)，藍(lán)色立即轉(zhuǎn)黃色，450nm測OD值?。

　　三、關(guān)鍵注意事項

　　標(biāo)準(zhǔn)品處理?

　　需離心(10,000g, 1min)后梯度稀釋，渦旋混勻避免濃度誤差?。

　　洗滌控制?

　　自動洗板機(jī)建議設(shè)置浸泡30秒程序，手動洗板需拍干并更換吸水紙區(qū)域?。

　　加樣技巧?

　　使用多通道移液器垂直懸空加樣，不同濃度/樣本需更換吸頭?。

　　四、數(shù)據(jù)分析

　　以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)(log值)、OD450為縱坐標(biāo)繪制曲線，計算樣本濃度?。

　　若使用雙波長校正，需從450nm值中減去630nm或570nm背景值?。

　　注：以上資料僅供參考，完整操作請以實說明為準(zhǔn)，不同品牌可能存在細(xì)節(jié)差異?。

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